PHÂN TÍCH KIỂU HÌNH VÀ ỨNG DỤNG NGHIÊN CỨU TẾ BÀO T ĐIỀU HÒA ( TREGS) BẰNG KỸ THUẬT DÒNG CHẢY

Phân lập tế bào T điều hòa bằng MojoSort™

Bộ kit Human CD3/CD28 T Cell Activation Beads của chúng tôi cho phép tách chiết Tregs một cách dễ dàng và hiệu quả. MojoSort™ là hệ thống tách tế bào bằng từ tính, được thiết kế để phân lập và tinh sạch tế bào từ các quần thể hỗn hợp.

Bộ kit bao gồm hỗn hợp kháng thể gắn biotin và hạt nano Streptavidin Nanobeads, giúp phân lập tế bào T biểu hiện CD4 và CD25 với độ tinh sạch và hiệu suất cao. Phần tế bào được gắn nhãn từ sẽ được giữ lại nhờ bộ tách từ trong quá trình phân lập. Quy trình chi tiết được trình bày trong hướng dẫn sử dụng bộ kit.

Một hỗn dịch tế bào đơn được chuẩn bị từ lách chuột C57BL/6 để tiến hành phân lập âm tính CD4⁺ và lựa chọn dương tính CD25⁺, sử dụng MojoSort™ Mouse CD4⁺CD25⁺ Regulatory T Cell Isolation Kit.

Biểu đồ bên trái: tế bào sau khi phân lập âm tính CD4 và chọn lọc dương tính CD25. - Biểu đồ bên phải: tế bào trước khi loại bỏ CD4.

Sau đó, các tế bào được cố định và thấm màng bằng True-Nuclear™ Transcription Buffer Set, rồi nhuộm nội bào với kháng thể kháng FOXP3 (chuột) gắn Alexa Fluor® 488. Tế bào chết được loại trừ bằng thuốc nhuộm Helix NP™ Blue.

Cải thiện khả năng thu hồi tế bào Treg và NKT Ex Vivo bằng Treg-Protector™

Sản phẩm Treg-Protector (anti-ARTC2 Nanobody, ART2.2) là một nanobody ức chế ARTC2, một enzym ADP-ribosyltransferase gắn màng (GPI-anchored), được biểu hiện mạnh trên tế bào T điều hòa (Tregs) và tế bào NKT (Natural Killer T cells).

ARTC2 đóng vai trò trung gian trong quá trình chết tế bào do NAD+ gây ra (NAD+-induced cell death – NICD) và quá trình cắt proteolytic dẫn đến sự mất của các phân tử CD27 và CD62L trên bề mặt tế bào.

Việc ức chế hoạt tính của ARTC2 bằng Treg-Protector giúp cải thiện khả năng thu hồi (recovery) của tế bào Tregs và NKT trong quá trình tách chiết và phân lập tế bào.

Chuột chủng C57BL/6 được sử dụng để đánh giá hiệu quả bảo vệ tế bào Tregs của Treg-Protector™. Trước khi thu hoạch lách 15 phút, chuột được tiêm tĩnh mạch 50 µg Treg-Protector™  nhằm phân lập tế bào lympho (hình bên trái). Quy trình được thực hiện tương tự với chuột đối chứng, chỉ được tiêm PBS (hình bên phải).

Các tế bào thu được từ mỗi nhóm chuột được ủ ở 37°C trong 1 giờ, sau đó được nhuộm huỳnh quang với các kháng thể đặc hiệu gồm: CD3 Brilliant Violet 605™, CD4 FITC, CD25 PE/Dazzle™ 594, Annexin V Brilliant Violet 421™.

Tham khảo sản phẩm tại: https://www.biolegend.com/de-at/search-results?Keywords=CD3+Brilliant+Violet+605%E2%84%A2

https://www.biolegend.com/de-at/products/brilliant-violet-421-annexin-v-9286

Mẫu được phân tích bằng kỹ thuật flow cytometry, tập trung vào quần thể CD3⁺ và CD4⁺. Kết quả cho thấy nhóm chuột được xử lí bằng Treg-Protector™  có tỷ lệ tế bào T điều hòa (CD4⁺CD25⁺Annexin V⁻) sống cao hơn rõ rệt so với nhóm đối chứng chỉ tiêm PBS.

Kích hoạt mạnh mẽ tế bào T Cell

Human CD3/CD28 T Cell Activation Beads cho phép kích hoạt tế bào T người trong điều kiện in vitro mà không cần tế bào trình diện kháng nguyên (APC). Tế bào T người được kích thích bằng kháng thể đặc hiệu CD3 và CD28 được phủ trên các vi hạt siêu từ tính. Các vi hạt này được thêm trực tiếp vào hỗn hợp tế bào T đã được phân lập hoặc vào tế bào bạch cầu đơn nhân ngoại vi, giúp kích hoạt mạnh mẽ tế bào T.

Tế bào T CD3⁺ của người được nuôi cấy trong 5 ngày trong điều kiện có hạt kích hoạt CD3/CD28 sau đó đánh giá mức độ biểu hiện của PD-1. Tại bước nhuộm huỳnh quang, các tế bào được đánh dấu lần lượt: kháng thể CD3 (dòng SK7) gắn APC và kháng thể CD279 (PD-1) (dòng NAT105) gắn Brilliant Violet 421™. Sau đó mẫu được phân tích bằng kỹ thuật flow cytometry trong khi các mảnh vụn tế bào, tế bào chết và tế bào kép được loại trừ khỏi quá trình phân tích.

Tham khảo sản phẩm tại: https://www.biolegend.com/de-at/search-results?Keywords=Human+CD3%2FCD28+T+Cell+Activation+Beads

Tế bào T CD3⁺ của người được nuôi cấy trong 5 ngày trong điều kiện có hạt kích hoạt CD3/CD28 sau đó đánh giá mức độ biểu hiện của PD-1. Tại bước nhuộm huỳnh quang, các tế bào được đánh dấu lần lượt: kháng thể CD3 (dòng SK7) gắn APC và kháng thể CD279 (PD-1) (dòng NAT105) gắn Brilliant Violet 421™. Sau đó mẫu được phân tích bằng kỹ thuật flow cytometry trong khi các mảnh vụn tế bào, tế bào chết và tế bào kép được loại trừ khỏi quá trình phân tích.

Tham khảo sản phẩm tại: https://www.biolegend.com/de-at/search-results?Keywords=Human+CD3%2FCD28+T+Cell+Activation+Beads

Tăng cường sự phát triển của tế bào Treg bằng dung dịch thay thế huyết thanh

Tế bào Treg có liên quan đến sự tiến triển của bệnh và sự suy giảm hiệu quả điều trị của của các liệu pháp miễn dịch tế bào như CAR-T. Do đó, việc làm rõ vai trò của Treg trong liệu pháp tế bào là một yếu tố quan trọng.

Danh mục sản phẩm Cell-Vive™ GMP cung cấp các giải pháp nhằm nghiên cứu vai trò của tế bào Treg một cách nhất quán và có độ tin cậy cao.

Kết quả cho thấy, khi cho tế bào T chưa hoạt hóa (T CD4⁺ naïve) được nuôi cấy trong môi trường có kháng thể CD3/CD28 và IL-2, sản phẩm Cell-Vive™ Chemically Defined Serum Substitute cho hiệu suất tương đương với huyết thanh người AB, trong khi Cell-Vive™ T-NK Xeno-Free Serum Substitute gần như làm tăng gấp đôi số lượng tế bào Treg.

Các dung dịch thay thế huyết thanh này sẽ mang lại môi trường nuôi cấy tối ưu, có kiểm soát và an toàn, giúp thúc đẩy sự tăng sinh của tế bào Treg, đồng thời giảm thiểu các rủi ro tiềm ẩn liên quan đến việc sử dụng huyết thanh người AB.

Tế bào T CD4⁺ naïve người được kích thích bằng kháng thể Ultra-LEAF™ kháng CD3 và CD28 người (1 µg/mL), kết hợp với IL-2 tái tổ hợp người (200 IU/mL), hoặc bổ sung thêm TGF-β tái tổ hợp người (5 ng/mL) trong 6 ngày nuôi cấy. Quá trình nuôi cấy được thực hiện trong các điều kiện môi trường khác nhau bao gồm huyết thanh người AB, Cell-Vive™ T Cell CD Serum Substitute (GMP) hoặc Cell-Vive™ T-NK Xeno-Free Serum Substitute.

Phân tích thống kê ANOVA được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của các loại huyết thanh hoặc dung dịch thay thế huyết thanh đến mức độ xuất hiện của tế bào Treg. Kết quả cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.

Bộ kit FOXP3 và Flow Cytometry Treg Kits

FOXP3 là một yếu tố phiên mã được xem như gen điều hòa chủ đạo và là dấu ấn đặc hiệu hơn của tế bào Treg so với các dấu ấn bề mặt tế bào T thông thường như CD4, CD25 và CD127. Các nghiên cứu đã cho thấy rằng, sự chuyển nạp gen FOXP3 vào tế bào CD4⁺/CD25⁻ của chuột làm tế bào này biểu hiện các phân tử đặc trưng của tế bào Treg như GITR, CD103 và CTLA-4. Hơn nữa, sự biểu hiện quá mức FOXP3 ở chuột dẫn đến tình trạng suy giảm hoạt động miễn dịch cho thấy yếu tố phiên mã này giữ vai trò trung tâm trong việc điều hòa hoạt tính của tế bào Treg.

Ở chuột, FOXP3 tồn tại chủ yếu ở một dạng duy nhất. Ở người FOXP3 có hai dạng đồng phân: Dạng đầy đủ có đầy đủ các exon; Dạng FOXP3 Delta 2 thiếu exon 2 trong cấu trúc gen.

Các bộ kit Flow Cytometry và dung dịch đệm FOXP3 của chúng tôi là những công cụ hữu ích trong nghiên cứu quần thể tế bào T và các đáp ứng miễn dịch.

Được thiết kế cho cả tế bào người và tế bào chuột, bộ kit True-Nuclear™ Treg Flow Cytometry cung cấp nồng độ kháng thể và thuốc thử đã được tối ưu hóa, mang lại hiệu suất vượt trội và tính tiện lợi cao trong các thí nghiệm huỳnh quang đa màu.

Tế bào lympho máu ngoại vi người được nhuộm bằng bộ True-Nuclear™ Human Treg Flow™ Kit (FOXP3 Alexa Fluor® 488 / CD4 PE-Cyanine5 / CD25 PE).

Tham khảo sản phẩm tại:

https://www.biolegend.com/en-us/search-results?Keywords=treg+nuclear

Yếu tố phiên mã Helios

Helios là một thành viên thuộc họ yếu tố phiên mã Ikaros. Protein này có khả năng gắn vào vùng promoter của gen FOXP3, từ đó ổn định biểu hiện của FOXP3 và tăng cường chức năng ức chế của tế bào Treg.

Ở cả chuột và người, khoảng 70–80% tế bào Treg biểu hiện Helios, đặc biệt là biểu hiện mạnh trong tế bào Treg tự nhiên (tTreg) và ở mức thấp hơn trong Treg cảm ứng ngoại vi (iTreg).

Mặc dù ban đầu Helios được xem là một dấu ấn phân biệt Treg tự nhiên, nhưng các nghiên cứu gần đây cho thấy sự biểu hiện của Helios cũng liên quan đến quá trình hoạt hóa và tăng sinh của tế bào T, bất kể kiểu tế bào nào tham gia.

Tế bào lách của chuột C57BL/6 được nhuộm bề mặt bằng kháng thể kháng CD4 gắn APC. Sau đó, tế bào được cố định và thấm màng bằng bộ đệm True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set.

Tiếp theo, tế bào được nhuộm nội bào với kháng thể tái tổ hợp tinh khiết kháng Helios (dòng QA20A52) (hình bên trái); Nhóm đối chứng được xử lý với kháng thể đối chứng đồng loại (rat IgG1, κ) (hình bên phải). Sau đó cả 2 nhóm được nhuộm thứ cấp bằng kháng thể kháng IgG1 chuột cống gắn PE.

Tài liệu tham khảo: https://www.biolegend.com/en-us/treg/products